每次电转反应需100 ng的质粒。研美生物提供的CRISPR质粒文库均为100 ng/μL，向电转杯加入25 μL电转感受态和1 μL质粒即可满足要求。

是的。冻转感受态一般是10^7-10^8 cfu/μg质粒，电转感受态一般是10^9 cfu/μg以上，为了保证500x以上的sgRNA覆盖度，无论从什么途径得到的CRISPR文库质粒都应该进行电转扩增。

理论上1×10^6 cells提取出基因组量为6.6 μg，因此细胞样品低于1×10^6 cells为风险样本，经过流式等操作获得的细胞应尽可能＞4×10^5 cells。组织样品适中即可，过大则导致消化不完全。

细胞沉淀：贴壁细胞经胰蛋白酶消化后，离心收集细胞沉淀（干冰运输）; 悬浮细胞直接离心收集沉淀（干冰运输）。细胞沉淀可见管底芝麻大小。

活细胞：T25瓶，灌满培养基，细胞密度>80%（泡沫箱常温运输）。

冻存细胞：冻存细胞从液氮罐中取出，冻存细胞干冰运输，否则会影响 DNA 抽提质量。为了保证 DNA抽提质量，确保细胞在消化或冻存前，细胞状态良好，处于生长对数期。

基因组DNA：OD 260/280在1.8~2.0 之间，浓度≥50 ng/μl，体积>100 μl；

组织块：介于绿豆粒~黄豆粒大小之间即可（干冰运输）。

PCR产物：Qubit浓度≥10 ng/μL，5 μL；Nonadrop浓度≥20 ng/μL，5 μL。

细胞数计算方式：

在CRISPR筛选中，单载体系统和双载体系统的选择取决于实验需求。单载体系统简便，一次转染即可完成基因编辑，构建简单，一步到位地转入gRNA和Cas9，但感染效率低，质粒庞大导致构建、维护和传递难度大。而双载体系统高效，Cas9在细胞中稳定表达提高编辑效率，且灵活，可轻松更换gRNA质粒不影响Cas9表达，但操作复杂，需两次转染，且需额外构建和维护稳定表达Cas9的细胞株。若实验注重简便性和一次性构建整个编辑系统，单载体系统更合适；若追求更高编辑效率和更大灵活性，如多次更换gRNA进行筛选或验证，双载体系统更合适。

一个优秀的CRISPR质粒文库需要满足以下标准：

覆盖度高：应涵盖目标基因组的大部分基因，确保不会遗漏重要基因，公认的标准是文库覆盖度超过99%。研美生物的文库覆盖度超过99.9%

均一性好：文库中每个sgRNA的丰度应相对均匀，避免某些sgRNA过度或不足表达，影响筛选结果的准确性，公认的标准是文库均一性小于10，研美生物的文库均一性小于6。

在CRISPR筛选中，选择带荧光标记还是抗性标记的载体取决于实验需求。荧光标记载体便于实时监测基因编辑过程和快速分选高表达gRNA的细胞，但需要专业设备且可能受背景干扰；适用于需要实时监测或单细胞水平筛选的实验。抗性标记载体通过抗生素筛选保证稳定性，操作简单且成本低，但筛选时间长且无法实时监测；适用于大规模全基因组或长时间筛选实验。若实验需要实时监测或单细胞水平筛选且具备设备条件，建议选荧光标记载体；若更关注稳定性和成本控制且实验规模大或时间长，建议选抗性标记载体。

细胞上库时，优先选择增殖速度快、贴壁稳定、均匀平铺且易于消化的细胞。这些特性有助于提高操作效率并确保文库细胞的覆盖度和均一性。相反，增殖缓慢、贴壁不牢、抱团生长或难以消化的细胞，会增加操作难度，降低上库效率，最终可能影响文库的完整性和功能表现。

慢病毒包装要达到较好效果，需从多方面入手。首先，包装细胞的状态至关重要，细胞应处于对数生长期，生长旺盛且密度适宜（70%-80%最佳），这样细胞的代谢和增殖能力较强，更利于病毒的包装。其次，包装质粒及核心质粒的浓度对包装效果影响显著。一般而言，质粒浓度高于500 ng/μL（经Qubit测量）时，包装效果最佳；而当质粒浓度低于200 ng/μL时，包装效果会显著下降。我司的病毒包装试剂盒，内含高浓度的包装质粒和高效的转染试剂，搭配处于最佳状态、代数较低且包装效率更高的Lenti-X 293T细胞，能够显著提升慢病毒包装的效果，为您带来更高效、更可靠的病毒制备体验。

细胞和组织样品使用干冰寄送，基因组和PCR产物使用冰袋寄送即可，若地区较远，基因组和PCR产物也请使用干冰寄送。

测序单上所填样本信息与实际送样管上标注内容一致，若一个样品分装在多个离心管中，请在送样测序单中备注清晰。

客户单位、姓名、电话、邮箱为必填基本信息，sgRNA文库信息需填写正确文库ID（Scishare或Addgene网站文库ID）和骨架载体。送样单上样本名称需与寄送样品管上标注一致，报告中的名称填写最终获得测序报告分析中呈现的名称。

细胞样品需填写：样品管上标注名称、细胞数、报告中呈现的名称、物种名称以及样本类型。

组织样品需填写：样品管上标注名称、克重、报告中呈现名称、物种名称以及样本类型。

如寄送样本为直接送测样本（带有barcode），需填写正确的引物名称。

要初步判定慢病毒包装效果，可以通过观察转染后细胞的形态和状态来进行判断。通常情况下，慢病毒包装过程中会对包装细胞产生一定的毒性，这种毒性会随着病毒组装和释放而逐渐显现。

转染后24小时：在显微镜下观察包装细胞。如果细胞密度没有明显增加，部分细胞出现凋亡迹象（如细胞收缩、碎片化），少量细胞异常膨大，这通常是慢病毒包装成功的表现。这是因为病毒正在细胞内组装，导致细胞受到一定压力。

转染后48小时和72小时：继续观察细胞状态。如果凋亡细胞和异常膨大的细胞数量逐渐增加，到72小时时，90%以上细胞形态瓦解，这进一步说明慢病毒包装效果较好，病毒颗粒正在有效组装并释放，对细胞造成了较大损伤。

相反，如果在转染后24小时观察到细胞继续扩增，细胞密度较大且形态正常，说明细胞未受到明显毒性影响，这可能意味着慢病毒包装效果不佳。此时需要进一步排查原因，例如质粒转染效率、细胞状态或培养条件等。

从-80℃冰箱或液氮中取出冻存细胞，表面消毒后迅速置于37℃水浴锅中，轻柔晃动使其完全解冻。随后，将细胞悬液转移至含有9 mL预热培养基的离心管中，轻柔颠倒混匀。以1000 rpm离心3 min，弃去上清，加入1 mL新鲜培养基重悬细胞，吹打混匀后，将细胞悬液转移至培养皿中，置于培养箱中继续培养。使用我司的即用型冻存液，操作简便，复苏效率高达95%以上，能够有效保护细胞免受冷冻损伤，维持细胞的活性和功能。