CRISPR筛选技术通过高通量敲除或激活基因，系统性研究基因功能与表型的关系。慢病毒因其高效整合和稳定表达的特性，成为递送sgRNA文库的首选载体。然而，在实验设计中，浓缩慢病毒（如通过超速离心或PEG沉淀提高病毒滴度）可能引入多重技术风险。本文将详细探讨其背后的科学原理、实验偏差来源及替代方案，以期为研究者提供全面的技术指导。

    我们来看看张锋团队于2017年发表于Nature Protocols上论文，这篇论文类似CRISPR筛选红宝书，本文中未对慢病毒进行浓缩，病毒包装结束后直接过滤后分装保存于-80℃。此外，国外共享平台Addgene也向外提供慢病毒包装服务，对于  LentiCRISPRv2载体骨架而言，慢病毒为2*10^6/mL，为未浓缩病毒。

    一、慢病毒浓缩对CRISPR文库单克隆性的破坏

    1.1 单克隆性原则的核心地位

    CRISPR筛选的核心假设是：每个细胞仅携带一个sgRNA，且该sgRNA对应的基因编辑直接导致细胞表型变化（如增殖、凋亡、耐药性等）。这一假设成立的前提是实验满足“单克隆性”（Clonality），即MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）严格控制在 MOI ≤ 0.3。此时，病毒感染细胞的概率服从泊松分布，约70%的感染细胞仅携带一个sgRNA。

    1.2 浓缩病毒导致MOI升高

    浓缩慢病毒的本质是提高病毒颗粒浓度（如从1×10⁶ TU/mL浓缩至1×10⁸ TU/mL）。假设细胞数为1×10⁶，我们添加原始病毒量为300 ul（3×10⁵ TU，MOI=0.3），而浓缩后（1×10⁸ TU/mL）只需添加3 ul浓缩病毒即可达到相同MOI，微量吸样误差等操作可能导致MOI偏大。此外，浓缩过程的不可控性（如病毒颗粒聚集、滴度测定误差）常导致实际MOI偏大，此时单个细胞可能被多个病毒颗粒感染。

    1.3 多sgRNA整合的后果

    假阳性/假阴性干扰：若一个细胞同时整合了sgRNA-A（靶向促凋亡基因）和sgRNA-B（靶向无关基因），其存活表型可能被错误归因于sgRNA-B。统计学噪声加剧：高MOI下，不同sgRNA的整合数量差异会破坏文库的均一性。例如，某些细胞可能整合多个相同sgRNA（增强表型），而另一些细胞整合不同sgRNA（表型抵消），导致数据分析时无法区分真实信号与噪声。

    1.4 实验验证数据

    一项研究对比了MOI=0.3与MOI=3的筛选结果（Morgens et al., 2017）：在MOI=3条件下，约40%的细胞整合了≥2个sgRNA。靶向必需基因的sgRNA在MOI=3组中富集程度显著降低（因部分细胞因多sgRNA整合而存活），导致假阴性率上升30%。

    二、文库多样性丧失与比例失衡

    2.1 文库构建的复杂性

    CRISPR文库通常包含数万至数十万种sgRNA，每个sgRNA需在细胞群体中保持均等丰度。以Broad Institute的Brunello文库为例，其包含77,441种sgRNA，每个基因设计4条sgRNA，通过大规模合成与扩增确保比例均一，然而浓缩慢病毒可能导致这种分布发生改变。

    2.2 浓缩过程导致sgRNA丢失

    物理损伤：超速离心（如100,000×g，2小时）可能导致病毒包膜破裂，释放的RNA被RNase降解，部分sgRNA永久丢失。聚集效应：病毒颗粒在离心时因碰撞形成聚集体，这些聚集体可能无法有效感染细胞，导致某些sgRNA的实际递送效率下降。离心管吸附：聚丙烯材质离心管可非特异性吸附病毒颗粒，不同sgRNA的病毒因理化性质差异（如电荷、大小）可能被选择性吸附，破坏原始比例。

    2.3 数据偏差示例

    假设原始文库中sgRNA-X和sgRNA-Y的比例为1:1，若浓缩导致sgRNA-Y的病毒损失50%，则感染后细胞中sgRNA-X:Y变为2:1。在筛选后数据分析中，sgRNA-Y可能因“表型关联性不足”被错误过滤。

    三、病毒聚集与感染效率下降

    3.1 超速离心的物理作用

    离心时，病毒颗粒受到强剪切力与高速碰撞，导致：包膜结构变形：VSV-G蛋白构象改变，无法有效结合细胞表面受体（如LDLR）。核酸泄漏：病毒包膜破裂后，部分sgRNA释放至培养基中，被RNase降解。

    3.2 聚集体的感染障碍

    空间位阻：聚集的病毒颗粒（直径>1μm）难以通过细胞膜内陷形成的胞饮小泡（通常<200nm）。受体竞争：聚集体表面的VSV-G蛋白可能相互遮蔽，减少与细胞受体的结合位点。

    3.3 实验数据支持

    对比超速离心与直接感染（未浓缩）的病毒：浓缩后病毒滴度名义上提高100倍，但实际感染效率仅增加20倍（Bak et al., 2018）。透射电镜显示，浓缩病毒中约30%颗粒形成聚集体（直径>500nm）。

    四、替代方案与优化策略

    4.1 病毒生产优化

    包装细胞选择：HEK293T细胞因其高转染效率与病毒产量，成为主流选择。推荐使用非常适合高滴度慢病毒包装的LentiX293T并使用研美生物生产的CRISPR文库慢病毒包装试剂盒可获得高质量慢病毒。

    4.2 离心增强感染（Spinoculation）

    低速离心法：将病毒与细胞在800-1200×g下离心2小时，通过轻微离心力促进病毒吸附，感染效率可提高3-5倍（Pagès et al., 2019）。优势：避免病毒浓缩，维持MOI≤0.3，同时减少聚集风险。

    4.3 化学增强剂

    Polybrene（终浓度8μg/mL）：中和病毒与细胞膜的负电荷排斥，提高结合效率。硫酸鱼精蛋白（5μg/mL）：通过电荷相互作用稳定病毒颗粒，但需注意细胞类型依赖性毒性。

    4.4 感染条件调整

    延长孵育时间：将病毒与细胞共孵育从24小时延长至48小时（需定期补充培养基防止酸化）。分次感染：将病毒分两次加入（间隔12小时），累计提高感染率。

    五、总结与操作建议

    CRISPR筛选的可靠性依赖于单克隆性、文库均一性、细胞健康与感染效率四大支柱。浓缩慢病毒可能系统性破坏这些条件，导致数据失真。建议研究者优先通过优化生产与感染条件提高效率，仅在严格验证后谨慎使用浓缩病毒。以下是分步操作指南：

    1. 病毒生产：使用LentiX293T细胞，优化质粒比例，收集上清后0.45μm过滤。

    2. 滴度测定：通过qPCR（检测病毒基因组拷贝数）或荧光报告法（如GFP标记）确定原始滴度。

    3. 感染计算：按MOI=0.3计算所需病毒量，不足时优先采用离心增强法。

    4. 质量控制：感染后3天提取基因组DNA，PCR扩增sgRNA区域并测序，确认文库覆盖度>90%。

    5. 数据分析：使用MAGeCK算法，校正多sgRNA整合与文库偏差的影响。

    通过上述策略，研究者可在无需浓缩病毒的前提下，获得高可信度的CRISPR筛选结果。

    参考文献：

    Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nature Protocols (2017).

    Morgens, D.W., et al. Systematic comparison of CRISPR/Cas9 and RNAi screens for essential genes. Nature Biotechnology (2017).

    Bak, R.O., et al. CRISPR-Cas9 genome editing in human cells: Optimization and scaling. Cell Reports (2018).

    Pagès, J.-C., et al. Lentiviral vectors: From basic science to clinical translation. Human Gene Therapy (2019).