一、细胞膜蛋白文库构建的生物学挑战

    构建严格定义的细胞膜蛋白文库面临显著挑战，主要源于蛋白质亚细胞定位的动态性与多重性。以免疫检查点蛋白PD-L1为例，传统认知中其定位于细胞膜，但实验证据表明该蛋白同时分布于细胞膜、核质及细胞骨架系统（图1）。此现象提示：单一亚细胞定位的绝对划分在生物学层面具有局限性。

图1. PD-L1蛋白的多亚细胞定位示意图（核质、细胞膜、细胞骨架）

二、细胞膜蛋白的界定标准

    当前亚细胞定位信息的获取依赖于两类互补策略：实验证据，包括免疫荧光标记、亚细胞分级分离及蛋白质组学质谱分析；生物信息学预测，基于跨膜结构域（Transmembrane domains, TMs）、信号肽及定位特征基序（如NLS、MTS）的算法模型（如DeepLoc、TargetP）。值得注意的是，跨膜结构域虽是膜蛋白的核心特征，但其存在并不等同于细胞膜特异性定位。例如，Addgene文库#113345采用跨膜结构域TMs标准筛选的膜蛋白库，覆盖范围扩展至内质网、线粒体膜等内膜系统（图2）。

图2. 基于跨膜结构域的膜蛋白文库

三、Scishare细胞膜蛋白CRISPRko文库的分类与特征

    Scishare平台是一个面向学术界的共享平台（www.scienceshare.cn），基于不同筛选标准构建了系列细胞膜蛋白CRISPR敲除（CRISPRko）文库，具体参数对比如下：

 图3. 不同Scishare膜蛋白文库的区别

四、文库选择策略建议

    1. 基本覆盖：推荐SSLP018/SSLP054文库，其基因以及sgRNA数量较少（1万sgRNA左右），技术难度较低适合初学者；

    2. 深度覆盖：若需系统性研究细胞膜蛋白相关功能，建议采用SSLP034/SSLP057/SSLP059文库，核心细胞膜蛋白几乎均被纳入；

    3. 完全覆盖：当上述文库无法满足特定研究需求时，需扩展至全基因组CRISPRko文库，并通过生物信息学筛选膜蛋白靶点。