CRISPR筛选结合下一代测序（NGS）技术已成为功能基因组学研究的重要工具，但其成功依赖于CRISPR筛选的诸多环节。从文库质粒的制备到基因组提取，再到PCR扩增方法的选择，每一步的失误都可能导致数据偏差甚至实验失败。本文将从文库质粒质量控制、文库细胞构建对照设置、基因组提取质量优化，以及PCR文库构建方法选择四个关键层面，系统探讨如何保证CRISPR筛选后NGS文库的成功构建。

    一、文库质粒质量控制：避免空载体污染

    CRISPR文库质粒的纯度是构建高质量CRISPR筛选的基础。空载体污染（未插入sgRNA的质粒）会导致慢病毒中空载体浓度过高，后续测序数据中大量无效序列的干扰可能掩盖真实的筛选结果。

    1. 空载体污染的检测  

    酶切检测：通过构建是否成功文库质粒独一内切酶酶切，电泳检测酶切产物大小。以LentiCRISPRv2载体为例，空载体比含有sgRNA载体大1.5 kb。

    测序验证：进行Sanger测序，确认sgRNA插入的正确性，无污染文库会在20 bp sgRNA区域乱峰但其它区域单峰，而污染文库可以看到明显的空载体序列（图1）。  

图1 污染的sgRNA文库 Sanger测序图

    2. 其它载体污染

    其它文库sgRNA污染：因sgRNA文库扩增不严谨，可能混有其它文库sgRNA质粒，这种污染通过空载体污染监测无法排除，需要通过二代测序排除。

    其它载体污染：如果被其它含有慢病毒组件的骨架载体污染，通过常用的WPRE-R测序引物可能可以检测到污染源。

研美建议

推荐从Scishare平台（www.scienceshare.cn）购买文库质粒或者从Addgene购买经过我们扩增与质控，可以获得高质量CRISPR文库并排除以上污染。

     二、文库细胞构建：设置对照细胞药杀组

    CRISPR筛选通常依赖药物压力（如嘌呤霉素，Puro）富集成功转染的细胞，但药物浓度不当或药杀不彻底可能导致假阳性结果。野生型对照的设置是验证CRISPR文库细胞成功构建的关键。

    1. 药物浓度梯度测试  

    在正式实验前，通过梯度实验确定最低有效药物浓度（即杀死所有野生型细胞的Puro浓度）。此外，96孔板、6孔板、10 cm皿和15 cm皿因细胞数量的不同对Puro的反应存在差别，细胞数量越大Puro所需浓度越高。

    2. 野生型对照药杀设置

    使用未转染sgRNA文库的同源细胞，暴露于相同药物浓度，与sgRNA文库感染组同时进行药杀，以对照组细胞死亡而感染组存活作为是否有效的指针。

研美建议

推荐从研美生物购买Ready-To-Use的文库细胞，也可以委托我们进行文库细胞的构建，我们的Best Cell Pool操作流程可以保证获得高质量文库细胞。

    三、基因组提取质量：确保高产量

    基因组DNA（gDNA）的质量直接影响后续PCR扩增的效率，尤其是CRISPR筛选依赖的sgRNA扩增步骤需要在较大的覆盖乘数下进行实验，对于60000 sgRNA的全基因组文库，按照300x的覆盖度，需要从1.8*10^7细胞至少获得120 ug gDNA。

    1. 提取方法优化

    试剂盒选择：针对肿瘤组织或者细胞等不同类型选择适合的提取试剂盒，获得高产量基因组以满足下游扩增。

    2. 质量评估标准

    纯度检测：Nanodrop测定A260/A280比值（1.82.0为佳），排除蛋白质或酚类污染。 

    完整性验证：通过琼脂糖凝胶电泳观察gDNA片段（主带>10 kb），避免过度降解。

    定量准确性：使用荧光定量法（如Qubit）而非吸光度法，避免RNA或杂质干扰。

研美建议

推荐使用研美生物生产的专为CRISPR筛选优化的基因组提取试剂盒（GK101为酚氯仿抽提法适合肿瘤组织；GK102为柱式提取法适合细胞）。

    四、PCR文库构建方法选择：一步法与两步法

    sgRNA的扩增通常需通过PCR富集目标区域，一步法与两步法的选择需权衡效率与偏好性风险。

    1. 方法对比  

     一步法PCR：直接使用携带测序接头的引物扩增目标sgRNA区域。  

     优点：操作简单、耗时短、污染风险低。  

     缺点：长引物可能引入引物自扩增二聚体，可通过电泳切胶排除。  

     两步法PCR：首轮扩增sgRNA区域，次轮添加测序接头。  

     优点：接头添加更灵活，引物合成成本低。  

     缺点：步骤繁琐，交叉污染风险增加，过度扩增容易发生。

    2. 优化策略  

    循环数控制：一步法建议≤25循环，两步法首轮≤15循环，次轮≤10循环，以减少非特异性扩增。  

    高保真酶选择：使用包含Proofreading的高保真聚合酶降低错误率，且扩增能力要强。  

研美建议

推荐使用研美生物生产的一步法CRISPR筛选测序文库构建试剂盒（PK201适合LentiCRISPRv2；PK202适合LentiGuide-Puro）。

    五、总结

    CRISPR筛选文库的成功构建需系统性把控每个环节：从质粒纯化排除空载体，到细胞实验中设置严格的野生型对照；从基因组提取的严格质控，到PCR方法的合理选择。未来，文库构建流程或进一步简化，但实验设计的严谨性与细节优化始终是数据可靠性的基石。