目前，尽管以分子功能，信号通路甚至全基因组等定义的通用性文库已经具有广泛的应用，但是构建适合自身课题研究方向的个性化文库仍是非常重要的。作为普通的科研工作者来说，设计一个个性化的文库仍面临多种选择的焦虑：从头设计sgRNA？还是基于已发表的文库来构建sgRNA？在此，我们就这个问题简单的进行讨论。

    1. sgRNA文库的从头设计

    对于擅长CRISPR的专家或者生信专家而言，从头设计sgRNA似乎不是太困难，基于已有的算法模型或者开发新的算法，针对最新的基因组组装版本设计全新的sgRNA。这种方法的优点是：算法更新保障了sgRNA设计的质量更优，且易于更新，可以面向更多的物种来设计，灵活性较高。但是缺点也非常明显：对设计者的门槛较高，一般的科研工作者无法通过此方法设计出高质量的sgRNA文库。

    2. 基于已有的sgRNA文库构建专属文库池

    当前针对人、小鼠等模式物种，已有多种全基因组文库相继发表，包括基因敲除、激活以及抑制等不同类型的CRISPR文库。主流的全基因组文库主要由三个团队发布，分别是张峰，Jonathan Weissman以及David Root与John Doench团队。

    GeCKO v2是使用的比较多的一个全基因文库，同时包含了人和小鼠两个版本，是张峰于2014年发表的CRISPR 敲除文库，分别覆盖了19050和20611个基因。以A\B库的形式构建，每个子库中单个基因含有3条sgRNA，即全库中每个基因含有6条sgRNA。

    Jonathan Weissman团队随后于2016年开发了人和小鼠的全基因组CRISPR激活/抑制文库，均提供了5 sgRNA/基因和10 sgRNA/基因的版本。值得注意的是，为了提高sgRNA的表达水平，设计者将sgRNA的首个碱基均替换成G，即为：G+19bp sgRNA的设计。

    David Root和John Doench团队则在2016年在前人已发布的全基因组文库基础上进行了sgRNA设计的优化，发布了Brunello（人）和Brie（小鼠）的CRISPR敲除文库，每个基因则设计了4条sgRNA。随后，于2018年继续发布了人和小鼠的CRISPR激活/抑制文库，每个基因设计了6条sgRNA，分为A/B库两个子库。该文库在线设计工具GPP sgRNA Designer已公开于https://www.broad.io/gpp-sgrna-design (后期则更新工具名为CRISPick，相应的访问地址为：https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)。

    3. 在线工具辅助sgRNA文库设计

    除了前面提到的CRISPick外，还有其它一些设计工具可以辅助sgRNA文库设计。比如：基于VBC评分算法的在线工具：https://www.vbc-score.org/。该工具提供了人和小鼠在内的6种个模式物种的敲除sgRNA设计。可以单基因查询，也可以下载全基因组sgRNA文件进行线下多基因的查询。CHOPCHOP（https://chopchop.cbu.uib.no/#）虽然提供了多物种的sgRNA设计，缺点是无法同时实现多基因的查询。相比而言，CRISPick一次性可以最多在线查询500个基因，也提供了多物种的全基因组sgRNA设计文件下载途径（https://portals.broadinstitute.org/gppx/public/sgrna_design）。最重要的一点是它一直在不断更新sgRNA设计。设计者可以使用最新的sgRNA设计用于自己的文库。

    4. 如果我需要一个定制文库，sgRNA应该从哪里来？

    研究者的焦虑：既然有这么多预制库，那我是不是应该直接使用它们就可以了？还是说需要考虑定制设计自己的个性化文库？

    预制库具备时效性的优点，可以短期直接使用，无需花费时间再次构建。但是CRISPR领域的发展非常迅速，以至于任何静态的sgRNA文库在使用时可能都已经过时。张峰发布的文库是2014年以前设计的，距今已经超过11年之久。哪怕是John Doench团队团队发布的文库有7年了。但是值得注意的是，John Doench团队提供的在线设计工具一直有持续的更新，最新的版本直到笔者谈论的此刻，已经更新到了2024年11月。因此，利用CRISPick设计sgRNA文库是一个非常不错的选择，也是很多顶刊作者优先选择的工具，甚至有些科研工作者会指定该工具作为我们为其设计sgRNA文库的来源。这说明该设计工具得到了广泛的认可。

    有的客户可能会问：你们设计的sgRNA验证过吗？这反映出科研工作者对sgRNA设计质量的担忧。研美生物在为客户设计sgRNA文库时，其实提供了多种选择。客户可以自己提供sgRNA序列，也可以委托我司使用CRISPick进行设计。我司默认情况下会依托John Doench团队最新开发的在线设计工具CRISPick进行sgRNA设计，我们也推荐此方式来设计文库。此外还可以指定从公开发布的全基因组sgRNA文库中筛选目的基因的sgRNA。此外，我司也预制了人和小鼠的多种类型的CRISPR文库，包括敲除文库和激活文库等，也包括全库和亚库，每个文库均是基于CRISPick全新设计的sgRNA自主构建，质量优异，为科研工作者的高质量的文库筛选提供了保障。目前，这些文库均托管在一个学术公益平台SciShare：https://www.scienceshare.cn/。欢迎广大感兴趣的用户选择我们免费试用！

Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Sanjana NE, Shalem O, Zhang F. Nat Methods. 2014 Aug;11(8):783-4. doi: 10.1038/nmeth.3047IF: 36.1 Q1 . PubMed 25075903

Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Doench JG, Fusi N, Sullender M, Hegde M, Vaimberg EW, Donovan KF, Smith I, Tothova Z, Wilen C, Orchard R, Virgin HW, Listgarten J, Root DE. Nat Biotechnol. 2016 Jan 18. doi: 10.1038/nbt.3437IF: 33.1 Q1 . PubMed 26780180

Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Sanson KR, Hanna RE, Hegde M, Donovan KF, Strand C, Sullender ME, Vaimberg EW, Goodale A, Root DE, Piccioni F, Doench JG. Nat Commun. 2018 Dec 21;9(1):5416. doi: 10.1038/s41467-018-07901-8IF: 14.7 Q1 . PubMed 30575746