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文库病毒感染细胞NGS测序分析
获得文库病毒感染的细胞是进行CRISPR筛选的第一步,一个高质量的文库感染细胞是进行后续高质量筛选工作的前提,是获得有效数据的重要的保障。因此,在文库病毒感染细胞后非常有必要对文库细胞进行NGS测序评价。如果贸然对感染好的文库细胞直接进行筛选实验,后续测序才发现文库感染效果不佳就得不偿失了。对文库感染细胞的评价与质粒文库的评价是类似的,但是我们主要评价文库细胞的覆盖度和平衡性2个方面。研美生物对于文库感染细胞推荐测序完成500x 以上的reads数,计算文库的覆盖度、skew ratio以及Gini系数来完成对文库细胞的评价。同样地,覆盖度越高、skew ratio和Gini系数越小越好。01文库质粒一代测序
我们使用一代测序来检测文库中是否存在空载体或者其它载体的污染。主要可能存在的污染源是空载体的污染。这源于构建时载体酶切是否充分。有时候未充分酶切的载体会继续混入文库中,这为后续的文库质量带来了一定的影响。02文库覆盖度
文库设计的sgRNA是否有丢失是衡量一个优质文库的前提。保证99%以上的sgRNA能被覆盖是一个基础的前提条件。一般情况,我们都能实现99.9%以上的覆盖度,普遍能达到100%的覆盖度。03文库的平衡性
理想情况下,每个sgRNA的质粒在文库中的占比是一样的,但是实际情况下,只能保证大多数的sgRNA质粒在文库中的占比是接近的。我们一般用skew ratio(SK)(90% reads / 10% reads)和AUC值来评价文库的均一性。我们评价的标准是,当SK < 10,且0.5 < AUC < 0.7时则认为该文库的平衡性较好。研美生物自主构建的每一个文库均进行了以上严格的测试评价,高质量的文库是我们的追求,也是对客户的一份责任!对于扩增文库的项目,我们也提供相应的高质量的NGS分析服务,为客户轻松实现文库扩繁保驾护航!图1 文库质粒NGS质检分析 -
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文库病毒感染细胞NGS测序分析
图2 文库病毒感染细胞NGS建库分析流程 -
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CRISPR功能筛选细胞NGS测序分析
图3 实验流程