收到 GSmartTM DNA Recombinase 后请置于冰上融解，融解后使用移液器吹打混匀，并使用 0.2ml 的 PCR 管按照 10μL/管进行分装后于-20℃储存，避免多次反复冻融，多次反复冻融可能会影响酶的克隆效率。

-20℃保存。

GSmartTM DNA Recombinase 是一种简单高效的多段重组酶混合液，通过识别 DNA 插入片段和线性化载体末端同源臂（17bp-50bp），能够将单个或多个 DNA 片段与任意的线性化载体组装成一个完整的质粒，无需考虑片段长短或末端兼容性。同源臂可以在设计扩增目的片段的引物中引入。由于 GSmartTM DNA Recombinase 快速、简便、易用、灵活，同时也适用于大片段 DNA 构建，因此被快速应用到合成生物学中。

GSmartTM DNA Recombinase 在同一个反应管中、同一个反应温度下可高效的克隆 14 个 overlapping DNA 片段到线性化载体中，重组产物是完整的双链 DNA，可以用作PCR、RCA 的模板或其他分子生物学实验。

仪器耗材：

PCR 扩增用的模板、引物和 DNA 高保真酶

线性化载体

LB 培养基和 LB 平板

抗生素

高效价的感受态细胞

PCR 反应管、PCR 仪等

实验步骤

制备线性化载体

线性化载体可以通过限制性内切酶消化或 PCR 扩增获得。选择的克隆位点上下游100bp 区域内没有复杂结构序列（正/反向重复序列，高 GC 序列等），可以显著提高重组效率。

限制性内切酶消化制备线性化载体：推荐使用双酶切制备线性化克隆载体， 双酶切制备线性化载体可以有效降低克隆背景（残留质粒）；如果使用单酶切制备线性化载体可以适当延长酶切时间或稍微增加限制性内切酶使用量以使酶切反应尽可能充分，降低克隆背景。

PCR 扩增制备线性化载体：尽管可以使用 Taq DNA 聚合酶扩增制备线性化载体，但是为了减少引入突变碱基的可能性，建议选用高保真 DNA 聚合酶

（例如 GSmartTM pfu DNA 聚合酶，货号：DP1701）扩增载体。PCR 扩增制备线性化载体可以通过以下 3 种方法降低转化背景：1）减少环状质粒模板使用量，建议使用 1-10ng/50ul 反应体系；2）将质粒酶切线性化后再作为PCR 模板；3）若用环状质粒做模板，PCR 结束后使用 DpnI 消化去除环状质粒，降低转化背景。

制备插入片段

插入片段可以通过以下方式获得：

PCR 扩增

酶切质粒

互补引物退火

可以使用 Taq DNA 聚合酶扩增获得插入片段，但是推荐使用高保真 DNA 聚合酶。PCR 扩增引物由两部分组成：引物 5′端引入与其相邻的 DNA 片段（如载体或插入片段）末端 18-35bp 的同源臂（推荐 20-28bp），引物 3′端必须包含靶基因特异性的扩增引物序列。

引物设计需要遵循一般的引物设计原则，设计方法如下：

与载体相邻的两个插入片段的引物设计方法

最上游片段正向扩增引物设计：

5′-上游载体末端同源臂+基因特异性正向扩增引物-3’

最下游片段反向扩增引物设计：

5′-下游载体末端同源臂+基因特异性反向扩增引物-3’ 说明：

基因特异性正/反向扩增引物序列即常规PCR 扩增的正反向扩增引物。

常规脱盐引物（DSL 纯化）即可满足实验需求，但是如果引物长度超过 60bp 推荐使用PAGE 纯化引物，以便提高重组效率。

中间插入片段的引物设计方法：

正向引物：5′-上/下游片段末端同源臂（20-28bp）+基因特异性正向引物-3′

反向引物：5′-下/上游片段末端同源臂（20-28bp）+基因特异性反向引物-3′

有些感受态细胞需要 30℃培养，请以感受态细胞的培养条件为准。

阳性克隆鉴定

一般通过菌落 PCR 扩增鉴定阳性克隆：用无菌的吸头或牙签挑取单克隆至加有含抗生素的 200μL LB 培养基的 96 孔深孔板或 1.5mL EP 管，37℃、220-250RPM 振荡培养 1-5h，培养结束后直接吸取 3 μL 作为菌液 PCR 模板。

说明：

如果是高拷贝质粒，通常培养 1h 就能用于菌检，菌检PCR 使用 25 个循环即可；如果是低拷贝质粒，推荐 2-3h 培养时间，菌检PCR 使用 25-30 个循环；如果是单拷贝质粒，推荐延长培养时间至 5h, 菌检PCR 使用 30-35 个循环。

推荐至少用一条载体引物进行菌落PCR，这样可以有效避免菌检到假阳性克隆。

如果插入片段较多，可以分别菌检与载体相连接的片段，第一个片段菌检引物：载体正向引物和第一个片段反向引物；第四个片段菌检引物：第四个片段正向引物和载体反向引物。

问题 1：平板克隆少或不长克隆

检查平板的抗生素是否正确；

如果片段或载体是通过PCR 获得，检查引物是否正确，尤其要检查引物是否包含同源臂和特异性引物序列；

检查克隆载体和插入片段使用量的比例是否合适，调整片段和载体的加入量；

感受态细胞效价低。效价须大于 108 cfu/μg，此外，要选择克隆用的感受态细胞， 不要使用表达蛋白的感受态细胞；

如果片段或载体是通过琼脂糖电泳后割胶回收纯化，回收的 DNA 量较少达不到反应体系加入量要求，酶切产物和PCR 产物（条带单一，或非特异性条带较弱）可以直接使用试剂盒过柱回收纯化，或使用酚/氯仿/异丙醇沉淀的方式纯化。

问题 2：克隆不含插入片段

载体线性化不彻底，含有较多的残留质粒：如果使用酶切制备线性化载体，可以增加限制性内切酶的使用量并延长酶切时间，或用双酶切制备线性化载体；如果使用质粒作为 PCR 模板，通过 PCR 制备线性化载体，可以减少质粒加入量，并可选择

在 PCR 结束后加入 DpnⅠ限制酶消除残留的质粒模板；

重组时混有其他抗性相同的质粒：重组产物用 DpnI 消化，消除混入的质粒；

问题 3：菌落 PCR 无条带

菌检引物不正确：推荐菌检的引物分别能够和载体、插入片段结合；

如果使用基因特异性引物，检查菌落是不是仅含有空载体，如果是，建议重新制备片段或载体并重新进行重组反应；