CRISPR文库|全基因组文库和亚库筛选的比较

CRISPR文库|全基因组文库和亚库筛选的比较

在过去的十年中，CRISPR已发展成为一种有效的分子生物学工具，用于以多种方式快速修改基因或其表达。与此同时，基于CRISPR的筛选方式已被开发为强大的平台，用于剖析细胞行为的遗传基础以及药物靶点的发现。目前筛选的方式分为全基因组筛选和亚库筛选，筛选流程如图1所示。本文主要简要介绍了这两种筛选方式的区别以及各自的优缺点。

图1. 全基因组文库和亚库筛选的流程

       1. 全基因组筛选

这种筛选针对所有已知基因，在设计上没有偏见，因此最有可能识别影响研究表型的意料之外的基因。目前存在几个全基因组文库，可以相对较低的成本从Addgene中获得¹。然而，靶向大约20000个基因和对照也面临着挑战。通常，建议在此类筛选中为每个基因设计4-10条sgRNA，这会在全基因组筛选中产生至少80000条不同的sgRNA。此外，为了尽可能地覆盖整个文库，建议每条sgRNA至少使用500个细胞，从而在整个筛选中每个实验组有4000万个细胞。并且，需要较低的感染复数（MOI，病毒颗粒与被感染细胞的比值），以确保每个细胞仅被感染一条sgRNA。为了实现这一点，病毒库通常被稀释到25-30%的细胞被感染的水平²。因此，最初必须准备比筛选所需的细胞多三到四倍的细胞。在难以感染的细胞中，实现25-30%的感染率可能很困难，并且可能需要更大的起始细胞群。

全基因组 CRISPR 筛选所需的最小细胞数：

20 000 个基因× 4 gRNA/基因 = ~80000 sgRNA

80000 sgRNA × 500 个细胞/sgRNA = 每组约 4000 万个细胞

（25% 感染率 = 需要从超过 1.6 亿个细胞开始）

因此，全基因组CRISPR筛选需要大量细胞，这可能会给特定实验带来一些问题。例如已建立的癌细胞系通常很容易传代到无限数量，但是来自患者材料的特定原代细胞群和细胞可能难以或不可能获得如此庞大的数量。全库在特定的筛选条件也会受到一些限制。例如，小鼠体内肿瘤实验对可以给予受体小鼠的肿瘤细胞数量有限制。用于皮下抑制肿瘤细胞的实验，通常会少于100万个细胞，这与全基因组筛选所需的1.6亿个细胞相去甚远。

  2. 亚库筛选

亚库筛选首先要确定筛选基因的列表。有许多方法可以生成可能影响感兴趣表型的候选基因列表。包括基于RNA的方法，如RNA-seq、单细胞RNA seq³和空间转录组学方法⁴；基于DNA的方法，如ChIP-seq⁵和ATAC-seq⁶，以及蛋白质基于质谱的方法，磷酸蛋白质组学，以及不同的基于亲和力临近性的方法，如BioID70。候选基因列表也可以来自先前较大的CRISPR筛选或计算机预测。亚库筛选可以在上述的小鼠体内肿瘤模型中进行，在这种情况下，全基因组CRISPR筛选是不可行的。例如，这样的实验可以识别在给小鼠服用药物时影响肿瘤细胞存活的基因。

全基因组筛选和亚库筛选的比较总结如表1所示。总之，在决定筛选多少个基因时需要考虑几个因素。全基因筛选虽然可以进行无偏见的发现，但是需要大量细胞，在一些特定的筛选环境下很难进行（比如动物体内的筛选）。针对性的亚库筛选更加直接，可以基于研究人员的兴趣筛选特定种类的基因，并且通过控制亚库的大小可以实现在动物体内进行筛选，使得筛选的结果更加贴近真实的生理水平。此外，在Cell，Nature，Science三大期刊中统计2017年至2022年的文章，通过检索关键词CRISPR，亚库的有关文章上升的趋势明显快于全基因组文库（图2）。由此可见，相比于全基因组文库，CRISPR亚库的筛选是当今科研领域的热门技术。

表1. 全基因组文库和亚库筛选的优缺点比较

 图2. 2017-2022年CNS全基因组文库和亚库使用统计

       参考文献：

1. Doench J.G. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol. 2016;34:184–191.

2. Doench J.G. Am I ready for CRISPR? A user's guide to genetic screens. Nat Rev Genet. 2018;19:67–80.

3.  Sandberg R. Entering the era of single-cell transcriptomics in biology and medicine. Nat Methods. 2014;11:22–24. 

4. Stahl P.L. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science. 2016;353:78–82. 

5. Johnson D.S., Mortazavi A., Myers R.M., Wold B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 2007;316:1497–1502.

6. Buenrostro J.D., Giresi P.G., Zaba L.C., Chang H.Y., Greenleaf W.J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat Methods. 2013;10:1213–1218.