Cell-体内CRISPR筛选确定E3连接酶Cop1是巨噬细胞浸润和癌症免疫治疗靶点的调节剂

       2021年10月，X. Shirley Liu等在Cell 发表了题为“In vivo CRISPR screens identify the E3 ligase Cop1 as a modulator of macrophage infiltration and cancer immunotherapy target”的文章。文章通过体内CRISPR筛选确定E3连接酶Cop1是巨噬细胞浸润和癌症免疫治疗靶点的调节剂。

基本信息

       中文标题：体内CRISPR筛选确定E3连接酶Cop1是巨噬细胞浸润和癌症免疫治疗靶点的调节剂

       发表期刊：Cell

       发表时间：2021年10月

       影响因子：66.850/Q1

       研究对象：TNBC细胞系，免疫缺陷小鼠

       文库类型：肿瘤发生、发展和免疫调节相关的基因

       文库容量：超过4500 genes，每个基因5条sgRNA

研究背景

乳腺癌是美国癌症相关发病率和死亡率的主要原因之一，免疫检查点阻断（ICB）已显示出对皮肤癌、肺癌和结直肠癌患者的显著临床益处，尽管这一进展证明了ICB在乳腺癌治疗中的前景，但其益处仅限于少数个体，因此需要寻找新的免疫靶点来增强ICB反应并改善TNBC的预后。尽管调节肿瘤免疫和肿瘤微环境（TME）的分子机制尚未完全了解，他们也已知免疫系统在癌症进展中起重要作用。使用CRISPR-Cas9的功能基因组筛选已显示出作为发现新癌症靶点的稳健和无偏见方法的前景。它还被用于寻找新的肿瘤免疫调节剂，发现新的免疫肿瘤靶点，并剖析其机制。因此研究人员们使用体内CRISPR筛选在基因模型中鉴定更多的基因，以确定新的肿瘤免疫调节因子。

研究思路

研究方法

图1 CRISPR 筛选方法

研究人员在同基因BALB/c小鼠的4T1细胞中进行体内CRISPR筛选。为此，他们首先在4T1细胞中人工表达膜结合卵清蛋白（mOva），这是一种广泛用于增强同基因肿瘤模型中细胞免疫反应的方法。然后将慢病毒MusCK文库转导到表达mOva的4T1细胞中，并将感染细胞植入BALB/c Foxn1nu/nu小鼠、具有免疫能力的BALB/cc小鼠和移植前接种卵清蛋白的BALB/c小鼠的乳腺脂肪垫中。他们每只手臂用了12只老鼠，每只老鼠注射了足够的细胞来达到MusCK文库中所有sgRNA的覆盖率为200倍。移植后16天，他们收获移植的癌细胞进行分析，并观察到不同宿主中的肿瘤生长有显著差异。

研究结果

       1. 体内筛选MusCK文库发现经典和新颖的免疫逃避调节因子

为了分析CRISPR筛选结果，他们检测了体内生长的4T1肿瘤中sgRNA的丰度分布。与裸鼠免疫缺陷小鼠相比，对野生型免疫活性宿主肿瘤中耗尽的sgRNAs进行检查，发现了促进4T1癌细胞免疫逃逸的关键基因。作为阳性对照，在野生型小鼠移植的肿瘤中，靶向Cd274（Pd-l1）的sgRNA被耗尽，这与已知的Cd277在免疫抑制中的功能一致。在野生型小鼠中，干扰素γ途径的关键成分（Jak1、Jak2、Stat1和Irf1）显著减少，而在裸鼠中则没有，这表明癌细胞中IFNγ途径的缺陷可以抑制免疫逃逸。随后他们在TNBC细胞和小鼠中都验证了这一点。

       2. Cop1缺失使癌症对免疫治疗敏感

图2 第二次CRISPR 筛选

为了提高他们在体内CRISPR筛选的准确性，他们构建了第二个文库(MusCK 2.0)，重点关注在筛选中识别的79个候选基因，每个基因有8个sgRNAs。经过两轮体内筛选后，与裸鼠相比，在具有免疫能力的小鼠的4T1肿瘤中，Cop1出现了最显著的缺失基因，通过在体外和体内敲除Cop1，结果表明Cop1抑制增强了抗肿瘤免疫，通过一种也可能适用于TNBC以外的其他癌症类型的机制。

       3. Cop1 KO通过调节巨噬细胞相关趋化因子减少巨噬细胞浸润

图3 Cop1 KO转录组测序结果

他们将在IFNg处理下的4T1细胞中对Cop1 KO和对照Rosa26 KO进行了RNA-seq分析，基因集富集分析显示，免疫相关通路中下调的基因富集，包括肿瘤坏死因子α(TNF-α)信号通路、炎症反应、JAK-STAT信号通路以及趋化因子和细胞因子信号活性。通过流式细胞术和免疫组化和单细胞转录组测序分析，发现Cop1 KO上M2巨噬细胞减少，M1巨噬细胞浸润增加。结果表明，TNBC中的Cop1调节巨噬细胞在TME中的趋化作用。抑制Cop1可减少肿瘤巨噬细胞浸润，进而抑制肿瘤进展，提高生存率。

       4. C/ebpδ活性受Cop1 KO的调节

图4 C/ebpδ活性受Cop1 KO的调节

通过染色质测序分析以及蛋白组学分析，他们找到E3泛素连接酶Cop1的假定蛋白底物C/ebpδ。他们将仅含有Cop1 KO的4T1细胞或含有Cop1和C/ebpδ KO的4T1细胞植入小鼠中。他们观察到C/ebpδ KO完全挽救了肿瘤生长，说明Cop1功能障碍诱导的C/ebpδ积累是抑制4T1肿瘤生长的原因。这些结果证明，在4T1细胞中，C/ebpδ是Cop1的一个特异性蛋白底物，可介导Cop1 KO后染色质可达性增加，靶基因表达减少，肿瘤生长减缓。

       5. 通过适配器Trib2识别C/ebpδ作为Cop1的直接靶标

图5 Trib2-Cop1降解C/ebpd的原理图

最后他们想要阐明Cop1如何降解C/ebpδ蛋白，他们应用了一种机器学习方法该方法可以预测之前报道的已知Cop1底物中的脱除子。该分析预测了几种蛋白质作为4T1中Cop1最可能的直接底物，包括Trib2，Tanc1，Tex2和已知的底物Ets1，令人惊讶的是，预测底物不包括C/ebpδ或任何CEBP家族成员，这表明C/ebpδ可能是Cop1的间接底物。基于此，他们假设Trib2可能作为一个适配器，促进C/ebpδ和Cop1之间的相互作用，导致Cop1介导的C/ebpδ蛋白酶体降解，首先在野生型4T1细胞中进行了共免疫沉淀(CoIP)。这证实了内源性Cop1、Trib2和C/ebpδ的共结合，为了证明Trib2在介导C/ebpδ的Cop1降解中是重要的，他们使用CRISPR敲除Trib2。这些结果表明Cop1抑制可以稳定C/ebpδ以抑制巨噬细胞趋化剂的释放，可以增加肿瘤对免疫和免疫治疗的敏感性。

研究结论

在本研究中，他们使用大规模的CRISPR KO筛选技术，在微环境能力不同的宿主小鼠中发现使TNBC对抗肿瘤免疫敏感的基因。他们发现E3泛素连接酶Cop1通过适配器蛋白Trib2调节TF C/ebpδ的蛋白丰度。C/ebpδ在转录上抑制癌细胞巨噬细胞的趋化剂释放。他们的研究证实了Cop1在调节巨噬细胞浸润肿瘤和抑制免疫治疗效果方面的作用。