文库质粒测序及分析

构建好的质粒文库质量需要通过NGS测序及相关的分析结果来展示，其中文库的覆盖度，均一性，丢失率等是衡量一个文库质量的最重要的指标。利用扩增子测序获得的reads文件和自身开发的分析脚本，对构建文库过程中，转化效率、文库覆盖度、文库均一性以及质粒丢失率进行全面评价，为文库质量的检测提供全面的保障。

Figure 1 文库质粒一代测序验证

对文库质粒pool进行一代测序可以检验该文库是否存在比较明显的空载体污染，从而避免对后续筛选实验的影响。

Table 1 文库的转化效率

高效的转化率（colonies_per_sgRNA越高代表转化率越高）是文库质量和得率的关键因素，一般认为此数值应>500.

Figure 2 sgRNA的分布斜率图

横坐标为测序深度，纵坐标为sgRNA累积频率，左下值为累积频率达到10%时对应的sgRNA数目，左中值为达到90%时对应的sgRNA数目，Skew Ratio为二者比值。Skew Ratio作为sgRNA的分布斜率，可以反映出文库的均一性程度。一般认为此数值<10即被认为文库质量是可以接受的，越接近于1文库质量越高。

Figure 3 sgRNA read counts分布比例AUC图

对于一个理想的文库而言，每个sgRNA的数目应该是相等的，但是实际情况中，只能保证绝大部分的sgRNA分布几乎相同，少数sgRNA可能更多或者更少。使用AUC来评判文库sgRNA分布的均一性是除skew ratio之外的另一重要参数，一般认为AUC值<0.7就符合CRISPR文库的接受范围。