Cancer Discovery-CRISPR体内筛选发现SLC5A3和MARCH5两个基因对于AML细胞生长的重要作用

        2022年2月，来自Dana-Farber Cancer Institute and Boston Children’s Hospital 的Kimberly Stegmaier课题组在Cancer Discovery上发表了An In Vivo CRISPR Screening Platform for Prioritizing Therapeutic Targets in AML的文章。文章通过CRISPR体内筛选，发现了SLC5A3和MARCH5两个基因对于AML细胞生长的重要作用。

基本信息

       中文标题：体内CRISPR筛选AML治疗新靶点

       发表期刊：Cancer Discovery

       发表时间：2022年2月

       影响因子：38.272/Q1

       研究对象：人AML细胞，小鼠模型

       文库类型：与AML细胞生长相关的CRISPR KO亚库筛选

       文库容量：200个靶点，1320条sgRNA

研究背景

急性髓系白血病（AML）是一种异质性血液恶性肿瘤，其特征是异常成髓细胞的积累。尽管化疗和干细胞移植对一些患者有疗效，但AML的治愈率总体保持在35%至40%之间，老年人的治愈率不到15%。因此需要继续努力为这些患者确定新的治疗策略。CRISPR–Cas9筛选方法已成为在哺乳动物细胞中无偏地发现必要基因的有力工具，但是这些大规模的遗传筛选主要在体外进行。因此，作者优化了原位异种移植模型中CRISPR筛选的方案，以系统评估基因组规模CRISPR-Cas9体外筛选中出现的顶级AML依赖性的生理相关性。

研究思路

研究方法

图1 CRISPR体内/体外筛选策略

研究结果

       1.作者首先根据DepMap Avana CRISPR–Cas9筛选数据集，并与shRNA联合筛选以及AML细胞系中的聚焦体外CRISPR筛选的结果进行交叉分析，最终挑选出200个基因，并为每个基因设计了三个sgRNA和三个内含子控制sgRNA。最后加入120个额外的阴性对照sgRNA，构建了一个包含1320个sgRNA的文库。接下来作者构建了用于体内筛选的PDX小鼠模型，使用表达Cas9的MV4-11和U937细胞系以及PDX16-01进行体内和体外平行筛选。

测序结果显示，在所有三种模型中，代谢和线粒体相关通路都得到富集，这与最近的研究结果一致，即AML细胞依赖独特的代谢和线粒体特性生存。接下来，我们将重点放在先前未被描述为AML依赖性的靶点上，这些靶点在三种模型中均得分较高:钠/肌醇共转运体SLC5A3和线粒体定位的环型泛素E3连接酶MARCH5。

图2 CRISPR筛选鉴定SLC5A3和MARCH5为新的AML潜在靶点

       2. 我们使用两个独立的SLC5A3靶向sgRNAs在几个AML细胞系和PDX模型中验证了这种依赖性。SLC5A3的缺失抑制了AML细胞的生长，同时在小鼠模型中，SLC5A3的缺失促进了AML细胞的凋亡。与对照组相比，接受SLC5A3敲除细胞的小鼠骨髓抽吸评估显示白血病负担显著减少，生存时间延长。

由于SLC5A3是一种主要的肌醇转运体，我们研究了SLC5A3失活导致的AML生长缺陷是否源于肌醇缺乏。在培养基中添加补充肌醇后，SLC5A3敲除细胞的增殖完全被挽救，因此，培养基中基础肌肌醇的消耗在很大程度上阻碍了亲代AML细胞的生长，导致类似SLC5A3缺失的表型，细胞周期的改变与细胞环境相关，并诱导凋亡细胞死亡。这些数据表明肌醇是AML的重要代谢物。

3. 肌醇-3-磷酸合酶1 (ISYNA1)的低表达预示着AML细胞系对SLC5A3的强烈依赖性。ISYNA1编码肌醇生物合成途径中的限速酶，因此，我们推测SLC5A3在肌醇生物合成能力不足的AML细胞中至关重要。ISYNA1蛋白在对SLC5A3缺失敏感的AML细胞中低表达，而且ISYNA1过表达可以完全缓解SLC5A3依赖性。此外，在ISYNA1高细胞系M07E中敲除ISYNA1加剧了与SLC5A3耗竭相关的生长缺陷。总之，这些结果强有力地证明，SLC5A3是维持足够的肌醇水平以支持AML增殖所必需的。

图3 SLC5A3是维持AML增长所必需的

       4. 验证AML细胞对MARCH5的依赖性。CRISPR或shRNA靶向MARCH6会在各种AML细胞系和PDX模型中诱导严重的生长缺陷，并在小鼠模型中显著减慢了AML的进展，使其生存期延长。这些结果表明，靶向MARCH5可以在体外和体内抑制AML细胞的进展。

作者进一步确定健康人CD34+造血干细胞和祖细胞（HSPC）是否需要MARCH5。MARCH5缺失显著损害了AML细胞的集落形成能力，导致集落数量减少80%以上，并大大降低了集落大小，与AML细胞相比，sgMARCH5核感染的CD34+细胞在红系和髓系中的集落数分别仅减少10%至30%和30%至50%，这些结果说明，与AML细胞相比，健康的人类HSPC对MARCH5的依赖性较低。

图4 MARCH5缺失抑制AML增长

       5. 由于MARCH5的缺失导致AML细胞凋亡，我们研究了抑制MARCH5是否能使AML细胞对抗癌治疗敏感。通过对3247种抗癌化合物库进行化学筛选，与对照细胞相比，58种化合物对MARCH5敲除细胞的抑制作用增强。venetoclax是一种BH3模拟物，可特异阻断BCL2，结果表明CRISPR敲除MARCH5确实使AML细胞对venetoclax敏感，同时venetoclax在体内也增强了MARCH5耗竭的抗AML活性。

图5 MARCH5失活增强了venetoclax的抗白血病活性

研究结论

我们使用CRISPR筛选以及PDX模型构成了一个筛选平台，用于优先考虑体外筛选中出现的AML靶点，用于治疗开发，其中SLC5A3和MARCH5被候选为AML中的两个首要靶点。根据DepMap数据集，在各种AML细胞系中观察到强烈的MARCH5依赖性，这表明其具有广泛的适用性。最后，我们证明了dTAG指导的蛋白质降解在模拟靶标的药理学抑制方面的效用，这是对AML靶向验证的一个有价值的补充，特别是对于研究没有可用工具化合物抑制剂的靶点，如SLC5A3和MARCH5。