CRISPR文库筛选之实验设计

CRISPR文库筛选之实验设计

CRISPR文库筛选不仅应用的物种范围广泛，还可以用于多种不同方向的研究，比如：非编码RNA的功能，疾病耐药性，细胞通路，细胞功能等。研究者们往往可以根据不同的研究目的，甚至是针对组学分析的结果，设计个性化的亚库进行进一步的功能筛选。另一方面，研究者还可以根据兴趣分子的特性选择不同类型的文库进行筛选。因此，CRISPR文库的选择非常灵活。关于各个文库类型之间的差别，可以看看我们之前的介绍。既然CRISPR文库筛选这么重要，功能如此强大，那该怎么开始自己的筛选工作呢？下面就为大家介绍一下几种常见的CRISPR筛选设计。

一、基于细胞系的CRISPR筛选

药物压力筛选

药物压力筛选是最普遍的一种。这里以CRISPR敲除库为例给大家介绍一下如何设计筛选实验（图1）。不论是药物抗性筛选还是敏感性筛选，均可以设计对照组和加药实验组。区别在于前者使用了高剂量的药物，后者则使用了低剂量药物。最终，经过高通量测序之后，通过比较对照组与实验组之间的sgRNA种类的差别及丰度变化即可判断哪些基因敲除后可以使细胞更加耐受药物或者变得更加敏感。

图1. CRISPR药物筛选实验设计示意图^[1]

细胞分选

除了使用药物压力筛选，研究者还可以通过FACS筛选特定的细胞类群，通过比较不同类群细胞之间的sgRNA丰度达到筛选功能性sgRNA的目的。分选可以通过表达的荧光蛋白实现（图2），也可以通过荧光抗体或者特体的荧光染料来捕获特异的细胞群体（图3）。

图2 基于荧光信号细胞分选的CRSIPR筛选^[2]

图3 基于荧光抗体捕获细胞的CRISPR筛选^[3]

单细胞CRISPR筛选

单细胞CRISPR筛选是将CRISPR筛选与单细胞转录组测序（scRNA-seq）相结合，探索基因功能和遗传调控网络的方法。经历文库筛选的细胞将被barcode标记，最后分别通过对sgRNA与mRNA测序，在单细胞层面比较sgRNA丰度变化以及细胞内转录水平的影响，在单细胞水平将细胞的“基因型-基因表达谱-表型”关联起来（图4）。

图4 单细胞CRISPR筛选流程示意图^[4]

二、基于类器官的筛选

与二维培养体系相比，类器官有助于阐明疾病的发展、稳态和发病机制，为疾病的诊断和治疗提供可能的新方法。德国Henner F. Farin团队于2020年开发了基于CRISPR-Cas9和人结肠类器官的肿瘤抑制因子筛选体系，该体系可以在体外培养和体内异种移植两个实验平台上应用，为高异质性的结肠癌提供个性化精准治疗手段（Michels et al., 2020）。在实验设计上，类器官的筛选与细胞系的筛选是非常类似的（图5），因此除去建立类器官筛选平台外，操作上不会增加太多难度。

图5 类器官的CRISPR筛选^[5]

三、基于动物模型的筛选

动物模型是现代生命科学研究的重要工具，特别是基因工程小鼠和大鼠，在基因功能研究、人类生理病理机制研究及新药研发中起着不可替代的作用。基于动物模型的CRISPR筛选能够帮助研究者直观地筛选到关键的功能基因（图6）。但是，因为考虑到动物筛选时用于筛选的细胞数目是有限的，而为了保证文库筛选达到有效的覆盖度，所以一般动物筛选的CRISPR文库都会比较小，这也一定程度上制约了该方法的普及性。

图6 基于动物的CRISPR体内筛选^[6]

四、基于细胞与动物的筛选

为了克服动物筛选的局限性，研究者还开发除了细胞+动物筛选的模式，即先进行常规的细胞系（或者类器官）筛选，然后将富集到的细胞（或类器官）植入动物模型中，最后比较植入前后富集到的sgRNA丰度的变化就可以筛选到相关的关键基因了（图7）。

图7 细胞结合动物模型的CRISPR筛选^[7]

近年来，CRISPR筛选技术的运用越来越广泛。在生命科学和医学领域研究中发挥着越来越重要的作用。同时，也产生了很多不同形式的筛选设计。高度灵活的CRISPR筛选将在未来相关领域的研究中发挥更大的作用。如果你还了解更多关于CRISPR筛选的研究，请继续关注我们公众号，我们将在这里陆续给大家带来最新的CRISPR筛选研究工作。

参考文献

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[3] Li B, Clohisey SM, Chia BS, et al. Genome-wide CRISPR screen identifies host dependency factors for influenza A virus infection. Nat Commun. 2020, 11(1): 164.

[4] Yang L, Chan AKN, Miyashita K, et al. High-resolution characterization of gene function using single-cell CRISPR tiling screen. Nat Commun. 2021, 12(1): 4063.

[5] Murakami K, Terakado Y, Saito K, Jomen Y, Takeda H, Oshima M, Barker N. A genome-scale CRISPR screen reveals factors regulating Wnt-dependent renewal of mouse gastric epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021, 118(4):e2016806118. [6] Wang G, Chow RD, Zhu L, Bai Z, Ye L, Zhang F, Renauer PA, Dong MB, Dai X, Zhang X, Du Y, Cheng Y, Niu L, Chu Z, Kim K, Liao C, Clark P, Errami Y, Chen S. CRISPR-GEMM Pooled Mutagenic Screening Identifies KMT2D as a Major Modulator of Immune Checkpoint Blockade. Cancer Discov. 2020, 10(12):1912-1933.

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