基因表达调控方法的比较与应用

基因表达调控方法的比较与应用

—siRNA、shRNA和CRISPR

我们在阅读文献和设计课题时，会发现研究者通常会选择构建例如siRNA、shRNA和基因敲除等载体来调控基因的表达，进而探究基因功能和分子机制。值得注意的是，在部分近几年的文章中，我们发现许多研究者选择通过构建CRISPR文库筛选关键基因，成功发现了基因的潜在功能和相关通路，为下一步的研究提供了极大便利。

那么，以上提到的这些实验方法在课题研究中能达到哪些目的呢？我们在设计自己的课题时又该如何对这些方法进行选择呢？下面就带大家一起来了解siRNA、shRNA和基因敲除载体，以及近几年兴起的CRISPR文库筛选这些实验方法各自的特点！

       一、基于RNAi的siRNA和shRNA导致基因沉默或抑制

小干扰RNA（small interference RNA, siRNA）和短发夹RNA（small hairpin RNA, shRNA）可诱导RNA干扰（RNA interference, RNAi）效应，通过目标基因的mRNA选择性失活来实现沉默或抑制目标基因的表达。

图1. 基于RNAi的siRNA和shRNA的作用原理^[1]

siRNA 3’端含有两个突出的非配对碱基，通过与目标mRNA互补结合序列特异性地实现mRNA降解，而shRNA包含一个环结构，可加工形成siRNA，也可通过与目标mRNA互补结合序列特异性地实现靶mRNA降解。利用载体把shRNA导入细胞核内，当载体稳定地整合到基因组中后，能被传递到子代细胞中，从而使基因的沉默可被遗传（图1）。

表1. siRNA与shRNA之间的比较：

       下调基因的表达可通过干扰或敲除的方式实现。其中干扰稳转株不能控制shRNA插入染色体的位置，且染色体上的shRNA有时会丢失。此外，shRNA也存在一定程度的脱靶风险，构建shRNA载体时通常会同时选择多个靶位点。基因敲除是利用CRISPR/Cas9技术在基因组水平上通过基因序列的改变使其基因功能丧失，敲除效果稳定，且不能恢复，但获得基因敲除稳转株的周期较长，成本稍高，此时需要我们通过综合评判来选择下调基因表达的方式。

       二、基于CRISPR/Cas9的单基因敲除

表2. shRNA和基因敲除的比较：

       近几年来，不少研究者通过CRISPR文库功能性筛选和富集，进而发掘出特定表型相关基因的工作被发表在CNS上，该方法也在近几年快速发展，逐渐成为一种新的趋势。三、基于CRISPR/(d)Cas9的基因激活、抑制和敲除文库

图2. CRISPRa和CRISPRi的作用机制^[2]

根据目的和作用效果的不同，CRISPR文库可分为CRISPR激活库（CRISPR activation，CRISPRa）、CRISPR抑制库（CRISPR inhibition，CRISPRi）和CRISPR敲除库（CRISPR Knockout，CRISPRko）。其中，CRISPRko是利用CRISPR-Cas9系统，从基因组学层面对基因进行敲除，在此基础上，研究中通过将Cas9蛋白进行催化失活，形成dCas9（dead Cas9），构建了CRISPR-dCas9系统，利用该系统，当dCas9与基因启动子的阻遏结构域融合，由于转录机制的空间位阻效应，可导致基因表达的抑制，从而能实现高效的转录沉默，即CRISPRi。当与转录激活因子（如VP64和p65）融合的dCas9靶向启动子和增强子区域，可导致基因表达的上调，即CRISPRa（图2）。

表3. CRISPRko、CRISPRa和CRISPRi的比较：

以上就是关于siRNA、shRNA和基因敲除，以及CRISPR文库（CRISPRko、CRISPRa和CRISPRi）各自的功能和适用场景，大家可根据课题需求，选择合适的方法，定能事半功倍！

参考文献

       [1] Lingor P. Regulation of Cell Death and Survival by RNA Interference–The Roles of miRNA and siRNA. Apoptosome, 2010: 95-117.

       [2] Gilbert LA, Larson MH, Morsut L, et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell, 2013, 154(2): 442-451.