Molecular Cell-CRISPR/Cas9筛选揭示了泛素连接酶在有丝分裂中的作用

       2021年3月，David P. Toczyski等在Molecular Cell 发表了题为“A comprehensive phenotypic CRISPR-Cas9 screen of the ubiquitin pathway uncovers roles of ubiquitin ligases in mitosis”的文章。文章通过对泛素途径的综合表型CRISPR-Cas9筛选揭示了泛素连接酶在有丝分裂中的作用。

基本信息

       中文标题：泛素途径的综合表型CRISPR-Cas9筛选揭示泛素连接酶在有丝分裂中的作用

       发表期刊：Molecular Cell

       发表时间：2021年3月

       影响因子：19.328/Q1

       研究对象：HAP1细胞系

       文库类型：人类E3连接酶以及DUBs

       文库容量：685个靶点，6306条sgRNA

研究背景

为了快速响应细胞内不断变化的条件，细胞通过翻译后修饰（PTM）改变其蛋白质组，从而丰富现有的蛋白质库，PTM包括磷酸化、乙酰化到泛素化，泛素是一种进化上保守的8.5kDa蛋白，通过涉及泛素激活酶（E1）、泛素结合酶（E2）和泛素连接酶（E3）的序列反应共价连接到底物蛋白的N末端或赖氨酸残基。E3连接酶已被证实与多种人类疾病相关，然而，人类600多个E3中的大多数还没有很好的特征。

研究思路

图1 研究思路图解

研究方法

图2 CRISPR筛选策略

为了系统地描述人类泛素蛋白酶体系统（UPS），他们对41种针对多种生物过程的化合物进行了CRISPR-Cas9筛选。他们生成了一个6306 sgRNA的部分定制UPS sgRNA库，包括629个人类E3催化元件、底物结合模块、结构元件以及56个非必需DUB。他们生成了四个独立的强力霉素诱导的Cas9 HAP1克隆来进行筛选。

研究结果

图3 CRISPR筛选结果

通过对测序结果的分析，他们确定了466个显著且重复敏感或耐药的E3/DUB化合物组合，约占所有基因的23.7%。首先他们确定了对基本生物学过程有影响的基因，如FBXO42突变体对有丝分裂抑制的敏感性非常特异，表明其在有丝分裂中有专门作用，而FBXW7突变体对41种化合物中的16种敏感或耐药；MYLIP/IDOL的突变使低密度脂蛋白（LDL）受体泛素化，以响应细胞胆固醇水平的变化等。

接下来他们为了独立验证他们的筛选结果，他们开发了一种内部控制的双色竞争性生长分析方法。将可诱导Cas9⁺ GFP⁺ HAP1细胞与BFP⁺ HAP2细胞混合，感染以1个基因为靶点的2-4个sgRNAs的小文库，培养持续8天，通过流式细胞术测量GFP/BFP比率。由11个靶向对照sgRNAs组成的池表明，Cas9的单独切割不会使Cas9⁺ GFP⁺ 细胞对这些化合物显著敏感。他们用15种不同的sgRNA微型池并行进行了分析，以验证E3/DUB的相互作用。

图4 对筛选结果的独立验证分析方法

       为了测试某些E3s突变时观察到的对有丝分裂抑制剂的敏感性是否与有丝分裂作用有关，他们在HAP1-Cas9细胞中生成了FBXO42、HUWE1、UBE3D、HERC2、UBE4B和RNF19A的sgRNA各1-2个。结果发现FBXO42、HUWE1和UBE3D对两种以上有丝分裂抑制剂BI-2536（Plk1）、秋水仙素和TAK-901（Aurora A/B）敏感，HUWE1对三者均敏感，说明HUWE1可能在有丝分裂中发挥更关键的作用。

图5 FBXO42、HUWE1、UBE3D、HERC2和UBE4B克隆突变细胞系对有丝分裂抑制剂高度敏感

接下来研究人员们发现FBXO42、HUWE1、UBE3D、HERC2和UBE4B克隆突变的HAP1细胞系对有丝分裂抑制剂高度敏感，为了测试他们在HAP1细胞中验证的E3是否在另一个细胞系中重现，他们生成了骨肉瘤细胞系U2OS的小文库，每个池表达针对其中一个E3的组成性shRNA。他们选择的E3s基因的缺失会引起抗性，因为这些表型比敏感性更强，因为它们可以随着时间的推移大大超过对照群体。实验结果说明FBXW7, BIRC6和FBXO8总结了HAP1中观察到的抗性。

最后研究人员想要解明FBXO42, HUWE1和UBE3D使细胞对有丝分裂抑制剂敏感的机制。他们通过碘化丙啶染色以及免疫荧光显微镜等方法观察到HUWE1、UBE3D和FBXO42突变体的单极纺锤波频率比WT增加了6-9倍。在使用或不使用抑制剂的WT细胞和突变体中，还观察到其他异常的纺锤形形态，频率非常低。重要的是，在未受干扰的细胞中，他们还观察到HUWE1、UBE3D和FBXO42突变体的单极纺锤体增加了5-7倍。这些结果表明，HUWE1、UBE3D和FBXO42在正常细胞分裂过程中促进了双极纺锤体的形成。

图6 FBXO42, HUWE1和UBE3D是正常有丝分裂进程所必需的

因为HUWE1和UBE3D在许多细胞系中都是必不可少的，而FBXO42不是，所以他们将重点放在FBXO42上。为了测试FBXO42是否在其他细胞系中发挥类似的有丝分裂作用，他们生成了稳定的U2OS细胞池，与HAP1细胞一样，FBXO42缺失的U2OS细胞对有丝分裂抑制剂表现出显著的敏感性。他们发现FBXO42敲低导致中剂量tako -901处理后具有G2/M DNA含量的细胞显著积累。通过IMF，他们观察到使用低剂量BI-2536处理两个FBXO42 shRNAs 24小时后，FBXO42缺失的U2OS细胞中的单极纺锤波显著增加。他们的研究结果表明，FBXO42在HAP1和U2OS细胞的有丝分裂中发挥了重要作用。

研究结论

他们进行了化学-遗传CRISPR-Cas9筛选，以识别E3s/ DUBs，其丢失使细胞对41种针对广泛生物过程的化合物敏感或耐药，包括细胞周期进展、基因组稳定性、代谢和泡囊运输。一些基因，如FBXW7，显示出与许多化合物的相互作用。其他的如RNF25和FBXO42，主要表现为与单一化合物或一组相关化合物的相互作用。对有丝分裂抑制剂敏感的几个E3突变导致了异常有丝分裂的增加，表明这些基因在细胞周期调节中的作用。他们的CRISPR-Cas9筛选发现了466种基因复合物的相互作用，覆盖了25%的被筛选的E3s/ DUBs。